1) Nombre de la enfermedad y del agente etiológico
La marteiliosis está causada principalmente por dos parásitos protozoos del género Marteilia: Marteilia refringens, y Marteilia sydneyi ( phylum Paramyxea). La enfermedad se ha denominado de distintas formas: Enfermedad de los Aber (causada por Marteilia refringens), y enfermedad QX (causada por Marteilia sydney).
2) Especies hospedadoras
La especie hospedadora natural de M. refringens es la ostra plana europea (Ostrea edulis). También se han detectado infecciones naturales cuando se han introducido experimentalmente, en zonas infectadas por Marteilia, ejemplares de O. angassi, O. densellamellosa y de Tiostrea chilensis. Marteilia sydney parasita a la ostra Saccostrea glomerata (= comercialis) y posiblemete a Saccostrea echinata.
Es importante reseñar la presencia de Marteilia maurini y de Marteilia sp. en los mitilidos Mytilus edulis y M. galloprovincialis. En este momento se están desarrollando diversos estudios para definir la relación taxonómica entre estas especies de Marteilia.
Se ha detectado la presencia de Marteilia spp. en diversas especies de moluscos bivalvos: Crassostrea gigas, C. virginica, C. cucullata, Scrobicularia piperata, Cardium edule, Tapes pullastra, T. rhomboides, Modiolus modiolus, Solen marginatus.
De ahora en adelante, en este capítulo nos centraremos en Marteilia refringens, patógeno de declaración obligatoria para la Unión Europea.
3) Distribución geográfica
M. refringens se aisló por primera vez en la ostra plana de la Bretaña Francesa (Aber Wrach). Como consecuencia de las transferencias de ostra plana de unas zonas a otras, también se encuentra M. refringens en la zona intermareal del litoral atlántico de Francia, en Marruecos (laguna de Nador), España (costa mediterranea y atlántica) e Italia.
4) Sintomatología clínica y patologíca
M. refringens parasita la glándula digestiva de la ostra induciendo una decoloración de la misma y una reducción de la cantidad de glucógeno presente en las ostras afectadas. Las ostras parasitadas aparecen emaciadas con la consiguiente reducción del crecimiento y con episodios de mortalidad. La parasitosis va acompañada de cambios histopatológicos que afectan a las células del epitelio del estómago y de los túbulos digestivos que muchas veces experimentan cambios necróticos.
5) Epidemiología
La enfermedad se transmite naturalmente entre las ostras cultivadas. La infección tiene lugar durante el verano cuando la temperatura del agua está en torno a los 17 ºC. El modo de infección y el ciclo de vida del parásito aún no se conoce. No se ha conseguido reproducir experimentalmente la enfermedad en lel laboratorio por lo que se postula la existencia de uno o más hospedadores intermediarios.
6) Control de la enfermedad
Se debe evitar la introducción de ostras infectadas en zonas libres de esta enfermedad o durante la época de verano en zonas con temperatura del agua superior a los 17 ºC.
7) Métodos de diagnóstico
(Reconocidos por las UE y la Oficina Internacional de las Epizootías, OIE)
7.1) Método citológico
Para preparar las extensiones se corta un trozo de la glándula digestiva y de las branquias, eliminando el exceso de agua con un papel de filtro absorbente. A continuación se realiza una aposición del tejido (glándula digestiva) en el portaobjetos. Se deja secar el portaobjetos al aire y posteriormente se fija en metanol (2-3 minutos). Las preparaciones se tiñen con coloraciones hematológicas estándares. Una vez teñidas se lava el exceso de tinción con agua corriente, se deja que sequen al aire y se montan con resina.
El parásito, cuyas dimensiones en los estadios tempranos de desarrollo son de 5 a 8 µm de diámetro, puede alcanzar las 40 µm durante la esporulación. El citoplasma de la célula adquiere una coloración azúl más o menos intensa, mientras que el núcleo presenta un color intensamente rojo. Las células secundarias o esporoblastos están rodeadas por un halo brillante.
7.2) Método histológico
Se toma una sección de la ostra que comprenda el corazón, la glándula digestiva y las branquias incluyéndolo en un líquido de fijación como el de Davidson, Bouin o Carson, tal y como se indica en el apartado A.2 del capítulo de toma de muestras y análisis.
A la hora de hacer la fijación, debe respetarse una relación máxima de 1:10 entre el volúmen del tejido y líquido fijador. Las muestras se procesan tal y como se detalla en el capítulo de toma de muestras y análisis.
Existen diversas tinciones que permiten observar Marteilia (por ejemplo: Hematoxilina-eosina, tricrómico de Masson). Estos ejemplos no son exhaustivos y pueden emplearse otras coloraciones. Se recomienda observar al menos dos secciones por individuo.
Los estadios de desarrollo jóvenes de Marteilia se encuentran en el epitelio del estomago, los siguientes estadíos se encuentran en el epitelio de los divertículos o túbulos digestivos. Se pueden encontrar esporangios libres en el lumen del intestino.
7.3) Microscopía electrónica
Éste método se considera como confirmatorio ya que permite diferenciar entre Marteilia reringens y Marteilia sydneyi. Marteilia sydneyi no posee inclusiones en los plasmodios y en cada plasmodio se forman entre 8 y 16 primordios esporangiales, al contrario que en Marteilia refringens que sólo se forman 8. En cada esporangio de Marteilia sydneyi aparecen de 2 a 3 esporas mientras que en Marteilia refringens aparecen 4 .
7.4) PCR-RFLP
Esta técnica PCR- RFLP se desarrolló para diferenciar entre Marteilia refringens y Marteilia maurini. Para la detección de Martelia sydneyi se ha desarrollado una PCR.
En ambos casos se aisla el ADN de los bivalvos con el kit DNAzol (Invitrogen) siguiendo las instrucciones del fabricante o con fenol cloroformo. El análisis por PCR se llevado a cabo con los cebadores descritos en la bibliografía en un volumen de 25 µl con 2.5 µl de Tampón de PCR 10X (10mM de Tris, 50 mM de KCl (pH 8.3)), 2 mM de MgCl2, 0.4 mM de dNTPs, 0.4 µl de cada uno de los cebadores y 1.25U de enzima Taq polimerasa. Para la amplificación del ADN se realiza una desnaturalización inicial a 95ºC durante cinco minutos; seguidos de treinta ciclos de un minuto a 94ºC, un minuto a 55ºC y un minuto a 72ºC y por último una extensión final de diez minutos a 72ºC
Cebadores para la amplificación del Marteilia refringens
ITS1 4: 5´- CCGCACACGTTCTTCACTCC-3´
ITS1 5: 5´- CTCGCGAGTTTCGACAGACG- 3´
Cebadores para la amplificación de Marteila sydneyi:
LEG1: 5´- CGATCTGTGTAGTCGGATTCCGA- 3´
PRO2: 5´- TCAAGGGACATCCAACGGTC- 3´
Para diferenciar entre Marteilia refringens y Marteilia maurini se realiza un análisis de restricción con la enzima Hha1 en el producto de PCR obtenido para la amplificación de Marteilia refringens. Los fragmentos obtenidos en esta restrción se analizan en un gel de agarosa. El perfil correspondiente a Marteilia maurini es de tres bandas de 156, 157 y 68 pares de bases respectivamente, mientras que el perfil correspondiente a Marteilia refringens es de dos bandas de 226 y 156 pares de bases.
7.5) Hibridación in situ
Mediante la técnica de hibridación in situ se puede diferenciar entre las dos especies de Marteilia refringens y Marteilia sydneyi.
Para la técnica de la hibridación in situ se han diseñado unas sondas específicas para la deteción de ambas especies. Para la detección de Marteilia refringens , la sonda se obtiene realizanda una PCR a partir de ADN aislado de ostras infectadas con los cebadores SAS1 y SS2. La PCR se realiza con las condiciones descritas en el apartado anterior con la excepción de que se añade 1 µl de digoxigenina- dUTP 25 mM a la reacción.
Secuencias de los cebadores:
SS2: 5´- CCGGTCCCAGGTATATCTCG- 3´
SAS1: 5´- CCGGTGCCAGGTATATCTCG –3´
Para la detección de Marteilia sydneyis, la sonda se obtiene realizando una PCR a partir de ADN aislado de ostras infectadas con los cebadores LEG1 y PRO2, cuyas secuencias están descritas en el apartado 7.4. Al igual que en el caso de Marteilia refringens, la PCR se realiza con las condiciones descritas en el apartado anterior añadiendo 1 µl de digoxigenina- dUTP 25 mM a la reacción.
A la hora de realizar la hibridación in situ se deben incluir controles tanto positivos como negativos.
I) El tejido se procesa de la misma manera que para histología. Los cortes se tratan siguiendo técnicas convencionales de histología. Se corta a 6 µm de grosor y se colocan en protaobjetos cubiertos con 3-aminopropyltriethoxilano. Las secciones histológicas se guardan en un horno a 40ºC durante la noche.
II) Las secciones de tejido se desparafinan en 2 baños de xyleno durante 10 minutos seguidos de dos baños de 10 minutos cada uno en etanol absoluto para eliminar el solvente. Las secciones se rehidratan por inmersión en baños sucesivos de etanol. A continuación se lavan con PBS.
III) Las secciones se tratan con Proteinasa K (100 µg/ml en tampón TE) durante 30 minutos a 37ºC. Posteriormente, se deshidratan tras sucesivos baños de alcohol y se dejan secar al aire.
IV) Cuando están secas, las preparaciones se incuban con 100 µl de tampón de hibridación (4 x SSC, 50% formamida, 1 x Denhardt’s solution, 250 µg/ml tRNA de levadura, 10 % de dextran sulfato) conteniendo 10 ng de la sonda de oligonicleótido marcada con digoxigenina obtenida anteriormente para cada patógeno respectivamente.
V) Las secciones se cubren con cubreobjetos de plástico para hibridación y se colocan en un bloque caliente a 95°C durante 5 minutos. Antes de realizar la hibridación, las secciones se enfrían en hielo durante 1 minuto. La hibridación se realiza durante la noche a 42° en cámara húmeda.
VI) Las secciones se lavan dos veces durante 5 minutos en 2 x SSC a temperatura ambiente, y dos veces durante 10 minutes en 0.4 x SSC a 42°C.
VII) La detección se realiza siguiendo las instrucciones del fabricante del sistema de detección que se elija
VIII) Las secciones se lavan en agua destilada. Se contrastan y se montan usando una resina apropiada según el sistema de detección utilizado. La presencia de Marteilia refringens y Marteilia sydneyi respectivamente se revela por la aparición de células de parásito marcadas
8) Galería de imágenes
9) Referencias
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