La Bonamiosis se refiere a la enfermedad causada por Bonamia ostreae, un protozoo del Phylum Ascetospora, en el Hemisferio Norte y por Bonamia exitiosa y Mikrocytos roughleyi en el Hemisferio Sur aunque recientemente también se ha detectado la presencia de Bonamia exitiosa en Galicia (España). La enfermedad se conoce además con otros nombres: enfermedad de los hemocitos y enfermedad de las microcélulas.

De ahora en adelante, en este capítulo nos referiremos a Bonamia ostreae (patógeno de declaración obligatoria para la Unión Europea).

2. Especies hospedadoras

Bonamia ostreae se detectó por primera vez en la ostra plana (Ostrea edulis) y recientemente en O. conchaphila (= O. lurida). También se han detectado infecciones naturales cuando se han introducido experimentalmente, en zonas infectadas por Bonamia, ejemplares de O. angassi, O. densellamellosa y de Tiostrea chilensis.

3. Distribución geográfica

B. ostreae: Posiblemente  fue introducida en Europa desde los Estados Unidos (costa occidental), aunque actualmente también se encuentra presente en la costa oriental (Maine). En Europa se detectó por primera vez en Francia, y sucesivamente la enfermedad fue introducida en otros estados (Holanda, España, Portugal, Inglaterra, Irlanda, Italia y Grecia). Su distribución es muy variable.

También se ha descrito la presencia de Bonamia sp. en Nueva Zelanda y en algunas zonas del sur de Australia.

4. Sintomatología clínica y patológica

Las ostras infectadas pueden presentar síntomas clínicos macroscópicos. De hecho, en las branquias de los animales infectados, se pueden detectar indentaciones y perforaciones rodeadas de un color verdoso. Estos síntomas no son específicos de la enfermedad, pero al menos están presentes en su fase inicial.

Las alteraciones histopatológicas consisten fundamentalmente en infiltraciones hemocitarias detectadas en los órganos infectados, tales como el tejido conectivo de la glándula digestiva, las gónadas, las branquias y el manto.

B. ostrae se multiplica en los hemocitos que han fagocitado el parásito. Cuando los hemocitos mueren se pueden encontrar muchos restos celulares en la luz de los senos sanguíneos.

5. Epidemiología

La enfermedad se transmite de ostra a ostra. La fase inicial de la enfermedad puede afectar a moluscos de todas las edades. En caso de que la enfermedad sea endémica se detecta una mayor prevalencia en ejemplares de mayor edad. La enfermedad puede estar presente todo el año y la mortalidad inducida puede llegar al 90%, aumentando durante el verano.

Se pueden obtener infecciones experimentales mediante inoculación, contacto o alimentación. Existe una buena correlación entre la densidad de la población de ostras y la infección. Además el stress (turbidez, manipulación) favorecen la manifestación de la enfermedad.

6. Control de la enfermedad

Cada vez que se introducen ostras infectadas en zonas libres de este parásito se transmite la enfermedad de manera más o menos acentuada. Por tanto para prevenir eficazmente su difusión es necesario controlar tanto el estado de salud de las ostras como la especie introducida sobre todo en las tallas menores.

7. Métodos de diagnóstico

(Reconocidos por la UE y la Oficina Internacional de las Epizootías, OIE)

7.1 Método citológico (extensión de sangre)

En el caso de larvas se prepara un homogenado de tejidos y se deposita una o varias gotas en un portaobjetos. En el caso de ostras adultas se realiza una aposición de tejido cardíaco en un portaobjetos. En ambos casos se dejan las preparaciones que sequen al aire y posteriormente se fijan durante unos segundos en metanol. Una vez fijadas, las preparaciones se tiñen con coloraciones hematológicas estándares, se lava el exceso de tinción con agua corriente, se deja que sequen al aire y se montan en resina con un cubreobjetos.

El parásito (diámetro entorno a las 2 µm) aparece con citoplasma azulado y núcleo rojo. Puede verse fuera y dentro de los hemocitos.

7.2  Método histológico

Se toma una sección de la ostra que comprenda el corazón, la glándula digestiva y las branquias incluyéndolo en un líquido de fijación como el de Davidson, Bouin o Carson tal y como se indica en el apartado A.2 del capítulo de toma de muestras y análisis.

A la hora de hacer la fijación, debe respetarse una relación máxima de 1:10 entre el volúmen del tejido y líquido fijador. Las muestras se procesan tal y como se detalla en el capítulo de toma de muestras y análisis.

Existen diversas tinciones que permiten observar la Bonamia (por ejemplo: Hematoxilina-eosina, tricrómico de Masson). Estos ejemplos no son exhaustivos y pueden emplearse otras coloraciones. Se recomienda observar al menos dos secciones por individuo.

El parásito puede detectarse libremente en los tejidos y en los hemocitos.

7.3 Microscopía electrónica

La microscopía electrónica es un método catalogado como método confirmatorio ya que existen diferencias a nivel ultraestructural entre las distintas especies de Bonamia.

Las formas densas de B. ostreae presentan un menor número de haplosporosomas y tienen un ratio núcleo: citoplasma más pequeño que las formas densas de B. exitiosa

También existen diferencias a nivel ultraestructural entre M. mackini y otras especies de Bonamia. El núcleolo de M. mackini se situa hacia en centro del núcleo mientras que en B. ostreae éste tiene una posición eccéntrica. M.mackini no posee mitocondrias.

(Métodos de diagnóstico no validados por la UE y ni por la Oficina Internacional de las Epizootías, O.I.E)

Como ayuda a los sistemas de diagnóstico reconocidos se han desarrollado diversas técnicas: PCR específicas para la amplificación de Bonamia ostreae, e inmunoensayos con anticuerpos poli y monoclonales, aunque todavía estos métodos no están reconocios ni por la O.I.E ni por la UE

7.4 Diagnosis de Bonamia ostreae mediante inmunofluorescencia.

También puede identificarse Bonamia ostreae mediante inmunofluorescencia. Esta técnica puede realizarse tanto en larvas, como en ostras pequeñas y adultas. Una vez tomadas las muestras se realiza una extensión de un homogenado de larvas o una aposición de tejido cardíaco en un portaobjetos. Se deja secar al aire y se fija mediante inmersión en acetona durante 5-10 minutos. Estas preparaciones pueden emplearse directamente o congelarse a -20ºC para su empleo posterior.

Se prepara una solución de anticuerpos monoclonales conjugados con un fluorocromo en una solución tampón (NaCl 8g/l KH2PO4Na 0,2g/l, HPO4 12 H2O 2,9 g/l, KCl 0,2 g/l, Azida Na 0,2 g/l, Tween pH 7,4) empleando la solución recomendada por el suministrador de los monoclonales. También se pueden emplear anticuerpos policlonales.

Después de incubar en cámara húmeda durante 15 minutos a 20ºC, se monta en glicerina tamponada de baja fluorescencia y se observa al microscopio de fluorescencia con el filtro adecuado para cada fluorocromo. Si se observan células esféricas, de color verde brillante, confirma la infección por Bonamia ostreae.

7.5) Reacción en cadena de la polimerasa

Se extrae el ADN de las ostras con el kit DNAzol (Invitrogen) siguiendo las instrucciones del fabricante o con fenol cloroformo.

El análisis por PCR se lleva a cabo con los cebadores Bo y BoAs (Cochennec et al, 2000) en un volumen de 25 µl con 2.5 µl de Tampón de PCR 10X (10mM de Tris, 50 mM de KCl (pH 8.3)), 2 mM de MgCl₂, 0.4 mM de dNTPs, 0.4 µl de cada uno de los cebadores y 1.25U de enzima Taq polimerasa. Para la amplificación del ADN se realiza una desnaturalización inicial a 95ºC durante cinco minutos; seguidos de treinta y cinco ciclos de un minuto a 94ºC, un minuto a 55ºC y un minuto a 72ºC y por último una extensión final de diez minutos a 72ºC

Cebadores :     Bo: CATTTAATTGGTCGGGCCGC

                      BoAs: CTGATCGTCTTCGATCCCCC

Los productos obtenidos en la reacción de PCR se visualizan mediante luz ultravioleta en un gel de agarosa al 2 % teñido con bromuro de etidio (0,1 ug/ml)

Esta pareja de cebadores tambiém amplifica Bonamia exitiosa y M. roughleyi por lo que para distinguir entre las especies de Bonamia es necesario llevar a cabo un análisis de restricción sobre los productos de PCR obtenidos con los cebadores Bo-BoAs. El análisis de restricción se realiza con las enzimas Hae II y BgLI. Bonamia ostreae y Bonamia exitiosa se digieren con la enzima Hae II dando lugar a dos fragmentos de 115 y 189 pares de bases respectivamente mientras que M. roughleyi no se digiere. Por el contrario cuando la digestión se realiza con la enzima BgLI, B. exitiosa y M. roughleyi no se digieren mientras que B. ostreae se digiere en dos fragmentos (120 y 180 pares de bases respectivamente).

8) Galería de imágenes

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